“其实那两只老鼠不是我冷冻的，是我找别人讨来的。实话说，我也不知道那个人为什么会把老鼠冻这么久。”日本理化学研究所发育生物学中心的遗传学家若山照彦（Teruhiko Wakayama）十分愉快地回答记者的提问。他并没有在16年前就“处心积虑”地把老鼠冻起来为这项试验做准备。“老鼠不是我冷冻的”
其实，通过冷冻细胞进行克隆并不是什么新鲜事。第一只克隆动物多利就是利用的冷冻细胞。为多利提供遗传信息的“基因母亲”早在多利出生前3年就已经死去，研究人员冷冻保存了其活着的时候提取的乳腺细胞，后来用于克隆多利。而前不久黄禹锡也成功利用一只死于2002年的宠物狗米西（Missy）的冷冻细胞，克隆出了5只小狗，其中4只健康成长。
若山照彦相信，他们的研究成果将能够应用于克隆“复活”那些保存在永久冻土中的已灭绝动物，比如猛犸象。“这必定非常困难，但它将不再是一个科学幻想。” 若山照彦说。但其实，克隆猛犸象早已不仅是“科学幻想”，因为在2005年以前，韩国著名遗传学家黄禹锡就已经亲自动手操作过克隆试验了。当时他挪用了一大笔科研经费，从俄罗斯黑手党那里买来一些从西伯利亚冻土中挖出的猛犸象组织，前后共进行了3次尝试，均以失败告终。至于失败原因，中国农业大学李宁教授曾与黄禹锡私下探讨过此事，他告诉记者：“按黄禹锡的说法是，他还是没有得到完整的细胞。”
这部小说令人过目难忘，但合上最后一页，读者或许可以这样安慰自己——还好，这只是个故事。如今，这种“死而复生”的事情真实地发生了，而“来自地狱的使者”竟然是两只已经被冰冻了整整16年的老鼠。
上面这段摘自《约翰福音》的话，是美国恐怖小说家斯蒂芬·金的经典作品《宠物公墓》的开头。小说讲述了一个令人毛骨悚然的故事：一座神秘的坟墓可以让任何埋入的尸体死而复生，但复活后的生物却不再是它们的本来面目，那些黄眼珠的复活者带来了地狱的气息，他们或邪恶有腐烂味，或迟钝带泥土味……
不过，即使能够完整地得到猛犸象的遗传信息，想要最终将其克隆出来还有很多困难。首先就是必须找到合适的卵母细胞提供者。对于猛犸象来说，非洲象可能是最好的选择了，“但现代非洲象和古代猛犸象之间的生物学差异很大，要进行跨种克隆恐怕很难。”李宁教授解释说，跨种克隆只能在两个亚种之间进行，不能相隔太远，比如曾经有人尝试用老鼠和兔子、牛和羊进行克隆，结果虽然可以发育成早期胚胎，却从来没能真正出生过。“跨种克隆成功的前提之一就是，这两个亚种通过人为手段进行交配后，可以自然繁殖出后代。而猛犸象和非洲象会怎么样，没有人知道。”
如今在全世界范围内，有许多致力于扩大濒危物种种群规模的克隆计划，不过要实施这些计划，都需要对动物细胞进行冷冻，并且在冷冻前做必要的低温防冻处理，以保证细胞解冻之后仍然存活。“但很多动物园没有能力去获取动物细胞，并且用那样复杂的方式保存它们。”美国先进细胞技术公司的罗伯特·兰扎（Robert Lanza）在《新科学家》杂志上表示，“不过他们可以做到把死去的动物放进塑料袋然后冻到冰箱里去。”同样认可这项研究成果的还有南非国家动物园的保罗·巴特斯（Paul Bartels），他表示他将会要求生物学家们冷冻那些已经死亡的濒危动物的尸体。“我们将通过各种方法，让尽可能多的研究濒危物种的生物学家都注意到这项研究。”
除了“复活”已灭绝生物，若山照彦认为他们的研究还有另一个重要意义，那就是通过克隆保护濒危动物，保护基因多样性。
“为什么通过这个方法能够获得克隆动物呢？据我们理解，原因之一可能是在建立胚胎干细胞系以后，这些细胞在体外培养的过程中可能有利于染色体上一些小的损伤的修复——毕竟细胞冻死以后染色体肯定会受到很多损伤；如果直接进行核移植，染色体便没有时间进行修复。所以我们猜想这个培养过程是有利于DNA 修复的。”李劲松解释道。
“我们第一次证明，即使动物在死后被冷冻很长时间，它体内仍然有某些部分能够保持基因的完整性。这项研究可以用于克隆已灭绝的猛犸象，也可以用来保护濒危物种。”
此外，为猛犸象找代孕母亲也是一件麻烦事。“猛犸象比现在的非洲象体型大，如果用非洲象来生猛犸象，可能会有问题。”
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猛犸象全身长满耐寒的长毛，所以又叫长毛象，大约在1万年前便已灭绝，但如今不少人相信可以通过克隆来使其复活。“之所以有人这样想是因为它和别的化石不一样，”中科院古脊椎动物与古人类研究所研究员邓涛解释道，“比如恐龙化石已经彻底变成石头，没有留下什么软组织了；而一些猛犸象化石则完好地保存在西伯利亚冻土里面，就像是冷冻在冰箱里一样，因此它的软组织都保存下来。所以相对于其他化石来讲，猛犸象实现克隆的可能性是最大的。”
为了模拟在自然条件下被冷冻的状况，日本科学家将已经死亡的老鼠直接冻在了零下20℃的冰箱里，而没有预先进行任何低温保护处理。“我们分别准备了冷冻1周、1个月和3个月的老鼠各10只以上，而冷冻16年的就只有讨来的那两只。”若山照彦说。随后，为了考察到底冷冻后哪部分组织还保存有完整的遗传信息，科学家从老鼠的大脑、肾脏、胰腺等11处组织中提取死亡细胞里的细胞核，然后通过核移植技术，将这些细胞核注入去核的卵细胞中，从而得到克隆胚胎。试验表明，这样得到的胚胎的存活和发育率普遍很低，相比之下，只有来自于脑细胞的细胞核成功率最高，并且遥遥领先。“这确实让人意想不到，竟然能利用冷冻后的（老鼠）脑部细胞来克隆老鼠——如果材料是新鲜的成年老鼠脑细胞，任何人，包括我自己，都从来没有得到过克隆鼠。换句话说，冷冻后的脑细胞比新鲜的细胞还好用！”作为世界上第一位在1999年成功克隆出老鼠、有着十多年老鼠克隆经验的遗传学家，若山照彦自己也说不清这到底是怎么回事。在论文中，他这样解释道：我们知道多糖，比如蔗糖，可以被用来做抗冻剂，而大脑功能在很大程度上依靠葡萄糖（某些多糖的组成成分）。因此，可能是内源性的葡萄糖提高了大脑在没有低温保护情况下的抗冻能力。
利用从冷冻的老鼠尸体中提取的脑细胞，科学家制造出了健康的克隆鼠
“要确定长期冻存的动物能否克隆，首先要考虑细胞在冻死后是否还能进行克隆，也就是说核物质及染色体是否仍然保持完整性，这是第一步；而第二步才是试验从冷冻的尸体中取出的细胞还能否进行克隆。我们做的是第一步，他们做的是第二步。我们比他们早5个月。”李劲松对记者说。
长期以来，对于科学家来说，如果能够让那些已灭绝的动物重见天日，克隆或许就是最好的选择。但对于冰冻在永久冻土中的生物，由于它们的细胞早已死亡，而冷冻细胞中形成的冰晶也会使细胞内的基因物质受到严重损坏，因此能否成功地进行克隆，始终没有定论。但即便如此，若山照彦和他的同事们还是乐观地猜想：在那样冰冷僵死的生物体中，也许仍会有部分遗传信息没有受到损害——只要找到它们，就有可能克隆出已经灭绝的动物。
复活猛犸象，难度大得多
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在得到了克隆胚胎之后，科学家并没有直接将其放入代孕妈妈的子宫中，而是从中提取、培养出许多胚胎干细胞系，“这样便有了足够的包含着完整DNA的细胞可以使用”。然后，利用这些胚胎干细胞系，科学家进行了二次核移植，即从之前培育出的胚胎干细胞中提取细胞核，再次注入去核的卵母细胞当中，使其发育成新的克隆胚胎。然后，将这些新的胚胎移入代孕母鼠的子宫，19天后，一群健康的克隆鼠就诞生了。
不过尽管如此，绝大多数自然保护主义者还是认为，克隆只是在其他所有保护方法都失败的情况下的最后一种选择。因为克隆不是防止动物灭绝的制胜法宝。濒危动物所面临的最大问题是栖息地的消失、大规模捕猎以及气候变化。克隆技术只能让它们在动物园里苟延残喘，既不能有利于它们的进化，也无法改变致使其濒临灭绝的根源。
李劲松与其合作者先从活的老鼠身上取得活的细胞，然后不经防冻处理便将细胞放在零下80℃的温度下冷冻了近一年时间，使得细胞膜破裂，细胞完全死亡。随后，他们采取了与日本科学家同样的两步法，先进行核移植，建立胚胎干细胞系，然后再利用胚胎干细胞系进行二次核移植，得到克隆鼠。
“但原始动物是在死亡后整个尸体被冷冻起来的，而不单单是它的细胞。因此，利用冷冻细胞或冻死的细胞进行克隆，和从死亡后被冷冻起来的尸体中取出细胞再进行克隆，是有很大区别的。”若山照彦特别强调说。
耶稣就明明白白地告诉他们说：“拉撒路死了……如今我们去他那儿吧。”
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“总体来说，对于老鼠而言，用冷冻尸体进行克隆的成功率和用新鲜活体进行克隆的成功率几乎没什么差别。”若山照彦告诉记者。
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门徒互相看看，有些人不知道耶稣的话是带有比喻含义的，他们笑着说：“主啊，他若睡了，就必好了。”
濒危动物的最后选择
冷冻细胞不同于冷冻尸体
“通过这种二次核移植技术，我们总共得到12只克隆鼠，其中有4只是来自冷冻了16年的。”若山照彦告诉记者。这4只克隆鼠中，有1只因为呼吸衰竭出生后很快死亡，另一只不幸在第二天被养母给吃掉。还好，剩余的两只后来都健康地长到成年，与母鼠交配后，还产下了健康的后代。
耶稣对他的门徒说：“我们的朋友拉撒路睡了，我去叫醒他。”
不过，这些方法都是从活的动物体内取出活的细胞，进行低温保护处理后才进行冷冻保存，这样，解冻后的细胞仍然具有活性。那么如果细胞已被冻死，还能否实现克隆呢？中科院上海生物化学与细胞生物学研究所李劲松与其合作者于今年5月在美国《生殖生物学》杂志上发表论文称，他们已在去年第一次利用完全冻死的细胞成功培育出了克隆鼠。
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